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                      基因工程菌BphAB_LA_4_转化吲哚行为的研究

                      来源: www.koshiobi.com 作者:lgg 发布时间:2012-11-04 08:27 论文字数:40000字
                      论文编号: sb201211021628253899 论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:硕士毕业论文 论文价格: 150
                      利用不同方法固定基因工程菌BphAB—LA-4,其中海藻酸钠法固定的BphAB_LA>4有最高的转化活性,反应6 h后的靛蓝浓度为9 mg/L;利用两相体系成功避免了反应过程中出现的靛蓝被分解的现象.

                      1文献综述


                      1.1吲哚的概述
                      吲哚又称2,3-苯并吡咯,分子式为C8H7N,结构式如图1,是五元单环杂环吡咯与苯环稠合后形成;无色片状结晶,广泛存在于动物和植物体内,易溶于乙醇、乙醚、苯和热水;其化学性质与吡咯相近,几乎无碱性;低浓度吲哚有淡淡的芳香气味,常被用于化妆品、药物、染料、食品添加剂的合成。


                      1.1.2吲哚的来源及危害
                      吲哚及其同系物属于典型的难降解氮杂环芳香型污染物,主要来源于烟烟雾、焦化废水、煤矿开采工业污水。研究表明,这类化合物对生态环境以及人类健康会产生极大的危害,如:油页岩干馏生产合成燃料过程中产生的这类化合物对地》水和地下水造成了污染。


                      1.2吲哚转靛蓝的研究进展
                      随着吲哚转靛蓝的微生物资源逐渐丰富、相关技术手段的不断发展、实验手法的相对成熟、科研方向的逐步明朗,科技人员对吲哚转靛蓝的研究也走向多样化,对转化机理进行了深入探讨、对靛蓝产量进行了进一步优化、对吲哚同系物转化进行了初步的探索、对转化工艺的使用进行了更多的思考。以下,以机理、产量、副产物、同系物、转化工艺五个方面展开讨论。


                      1.2.1 基因机理的研究
                      吲哚在芳烃加氧酶的羟化作用下能够生成靛蓝,不同的加氧酶,加羟位置和数量的不同,产生了不同的转化途径,同时也导致了靛蓝形成的机理不同,根据加羟的数量以及羟化产物的结构,我们将吲哚转靛蓝的途径大致分为单加氧途径、双加氧途径以及环氧化途径,具体分析如下-(1)单加氧途径关于吲哚转靛蓝的研究中,已开发的单加氧酶种类相对较多,包括细胞色素P450单加氧酶、黄素单加氧酶、甲苯单加氧酶、 二甲笨氧化酶、苯酚羟化酶等。其中对细胞色素P450系列酶系转化吲哚研究的最为透彻,科研人员结合生物信息学手段、随机突变技术、定点突变技术以及产物分离鉴定技术,提出了该反应途径的详细原理以及反应过程中所涉及到的重要中间产物。1999年,Gillam团队发现在异源表达的细胞色素P450s单加氧酶可以生成靛蓝。随后,又对该类酶将转化为靛蓝的行为作了深入的研究,分离分析了吲哚转靛蓝过程中的重要中间产物以及副产物,包括3-羟基吲哚(indoxyl)、靛红(isatin)、羟吲哚(oxindole),靛玉红(indirubin);明确了 P450s在整个反应过程中所参与到的环节;提出了引哚转靛蓝行为中的经典单加氧途径。


                      2基因工程菌BphAB LA.4的构建及其功能基因的表达


                      微生物转化具有化学转化无法比拟的优势,以其绿色无污染、高特异性、易控制等特点而深得人心。将与转化相关的基因进行体外表达从而构建成转化载体-基因工程菌,已是当前生物转化的必要手段之一。
                      本章旨在研究:(1)通过分子对接软件,对联苯双加氧酶转化吲哚的可行性进行分析;(2)基因工程菌BphAB_LA-4的构建;(3)功能基因的表达优化,包括温度、培养基、诱导剂IPTG的添加量。


                      2. 1   材料与方法


                      2.1.1   实验材料
                      (1) 化学试剂本章所用化学试剂见表2.1,其他化学试剂均为国产分析纯。


                      2.2结果与讨论


                      2. 2. 1分子对接联

                      苯双加氧酶(BphA)是芳烃PlH七陶的种,多环芳介物,如联苯、多氯联苯、二苯并呋喃等。 BphA Ricskc '('i II Idlil:^铁NAD(1>)依赖加氧酶,包括末端双加氧海(a亚基和p亚基分別山hph.U 1-11 hphA2编码)、铁还原蛋白(bphA3编码)和铁氧还原蛋白还原酶(6/l44编码)[931。其中,由编码的a亚基BphAl对底物的识别以及结合起到了至关重要的作用。通过分子对接软件,将BphAl_LA>4分别与其自然底物联苯,以及本实验待研究底物吲哚进行模拟,可以直接观察到这两种底物与酶的结合情况,为反应的可行性提供了有力的分析依据。吲哚也可以与酶活性中心的二价铁离子Fe(II)结合,其C2/C3与Fe(II)的距离为4.7/4.6 A,与联苯相差不大(3.6/4.1 A)。已有研究表明,底物与Fe(II)的距离越近,就越容易与酶结合,因此,理论上,吲哚也可以成为联苯双加氧酶的底物之一。另外,吲哚的吡咯环的N原子可以与活性中心的氨基酸残基Gln-231和Asp-235形成氢键,使吲哚与酶的结合更加牢靠。以上结果证实,联苯双加氧酶与吲哚进行反应是可行的。


                      3 基因工程菌转化吲哚的条件优化................................36-45
                          3.1 材料与方法................................ 36-38
                              3.1.1 实验材料................................ 36-37
                              3.1.2 实验方法................................ 37-38
                          3.2 结果与讨论................................ 38-43
                              3.2.1 转化条件的优化................................ 38-40
                              3.2.2 转化产物的鉴定 ................................40-42
                              3.2.3 转化机理的推测................................ 42-43
                          3.3 本章小结................................ 43-45
                      4 水-有机两相体系结合固定化技术的应用................................ 45-53
                          4.1 材料与方法................................ 45-47
                              4.1.1 实验材料................................ 45-46
                              4.1.2 实验方法 ................................46-47
                          4.2 结果与讨论 ................................47-52 
                      4.3 本章小结................................ 52-53


                      结论


                      本论文首先利用生物信息学手段,通过对目标蛋白进行同源模建及分子对接等操作,分析了研究的可行性。接着成功构建了基因工程菌BphAB—LA-4,通过对诱导温度、IPTG的添加量、培养基的优化,确定了提高休眠细胞活性的最佳诱导条件,并通过SDS-PAGE分析了可溶性蛋白表达与休眠细胞活性提高之间的关系。在此基础之上,继续研究了转化条件:生物量、吲哚浓度、葡萄糖浓度三个主要因素对吲哚转靛蓝的影响,利用液质联机鉴定出转化产物,分析推测出BphAB—LA4休眠细胞转化吲哚的最可能机理。改进休眠细胞转化n引哚的工艺,选择三种常用固定化技术中,效果最佳的海藻酸钠包埋法将休眠细胞固定,结合水-有机两相体系,对吲哚转靛蓝进行研究。确定出最佳条件,解决了微生物转化B引哚过程中经常出现的:产物靛蓝不易提取并且极易转变的问题。本文旨在为吲哚转靛蓝这样研究提供新的微生物载体,新的研究思路。得出以下具体结论-
                      (1) 吲哚分子的C2/C3可以与联苯双加氧酶大亚基BphAl_LA-4活性中心的Fe(II)结合,距离为4.7/4.6 A,n引哚分子吡咯环的N原子可以与活性中心的氨基酸残基Gln-231和Asp-235形成氢键,使底物与酶的结合更加稳固。
                      (2) 成功构建基因工程菌BphAB—LA>4,其休眠细胞可以将n引哚转化为靛蓝,SDS-PAGE分析发现各蛋白组分的表达绝大部分是以非可溶性蛋白的形式出现在BphAB一LA>4的粗酶沉淀中,优化得到可以增加可溶性蛋白表达量,从而提高休眠细胞活性的最佳诱导条件为:诱导温度为15 °C, IPTG的浓度为0.25 mM,培养基为寡营养培养基M9。在此条件下吲哚的最大转化率为95%,可溶性蛋白的表达量也有所提高,尤其是大亚基BphAl_LA-4更多的出现在粗酶上清中。
                      (3) BphAl—LA-4休眠细胞转化吲哚的最佳条件为生物量0.28 g/L,吲哚浓度200mg/L,葡萄糖浓度0.2%,在此条件下的靛蓝最大产量为44 mg/L。通过HPLC-MS鉴定得到转化产物主要包括靛红、靛蓝、靛玉红,其中靛蓝是主产物。推测其转化机理为:吲哚在BphA的作用下生成吲哚-2,3-二氢二醇,其转化过程需要的电子由大肠杆菌中的葡萄糖脱酶与葡萄糖反应不断提供。吲哚-2,3-二氢二醇在BphB的作用下生成的靛红,与其脱水生成的3-?基吲哚聚合形成靛玉红。同时,3-羟mm自发聚合生成靛蓝。


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